包含经修饰的PB1基因的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒和重配株甲型/PR/8/34流感病毒及用于改善HA(血凝素)和NA(神经氨酸酶)疫苗糖蛋白生成的方法。
1.一种经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒，其在表面上的HA-NA(血凝素和神经氨酸酶)糖蛋白数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550个糖蛋白，它具有编码SEQxa0IDxa0NO:2的PB1蛋白之H3N2流感病毒的PB1基因，和具有所述甲型/PR/8/34流感病毒HA和NA基因或具有选自如下的流感病毒的HA和NA基因：具有H3N2、H5N1、或H5N2亚型的病毒。
2.一种用于生成流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其特征在于在卵中或在细胞中扩增依照权利要求1的经修饰的流感病毒，该经修饰的流感病毒具有编码所述HA-NA疫苗糖蛋白的HA和NA基因。
3.一种用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白数量的方法，其特征在于它包括用编码SEQxa0IDxa0NO:2的PB1蛋白的H3N2流感病毒的PB1基因替换编码所述甲型/PR/8/34流感病毒SEQxa0IDxa0NO:1的PB1蛋白的PB1基因。
4.一种通过提高生成的糖蛋白的NA/HA比率来增加包含流感病毒的HA-NA糖蛋白的疫苗剂量的免疫原性的方法，其中通过在卵中或在细胞中扩增依照权利要求1的经修饰的流感病毒来生成所述糖蛋白。本发明涉及包含经修饰的PB1基因的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒，而且涉及实现具有经修饰的甲型/PR/8/34病毒的遗传背景的重配株(reassortant)病毒以供生成流感病毒的疫苗种子(vaccinexa0seed)的方法。由流感病毒引起的流感是一种遍及全世界观察到的常见病毒性呼吸系统感染，其在每个冬季藉由温带地区的流行性爆发而发展形成。目前，它仍然是肺炎后传染病死亡率的第二大原因。造成人类病理学的流感病毒是甲型和乙型流感病毒。鉴于乙型流感病毒以谱系形式传播，甲型流感病毒依照两种主要的表面糖蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原特性而分成病毒亚型。流感病毒在其表面上具有300-700个糖蛋白，理论的NA/HA比率是1至10。在人类中传播并引起季节性流行病的病毒是甲型(H1N1)和甲型(H3N2)病毒。因为流感病毒的主要贮存宿主(reservoir)是动物贮存宿主(禽和猪)，所以动物病毒可以跨越物种屏障并感染人。病毒如高致病性甲型禽流感(H5N1)病毒和流行性甲型(H1N1)病毒可以产生严重的公共健康问题。目前，疫苗接种是用于保护群体免于流感病毒的唯一有效手段。所谓的季节性疫苗提供针对传播的季节性甲型(H1N1)和甲型(H3N2)病毒及乙型病毒的免疫性。每年，它由WHO基于前一年的原型株限定。宿主的免疫应答主要是体液的，伴有针对HA和NA蛋白的中和性抗体的合成。由于这两种蛋白质的显著抗原性漂移，尤其对于甲型病毒，必须每年重新评估疫苗的组成。用于生成疫苗的标准方法首先依靠通过与甲型/PR8/34(H1N1)株的遗传重配在卵(egg)中对由WHO确定的三种原型株之每种获得疫苗种子。大多数疫苗生产商通常使用主要源自亲本甲型/PR/8/34病毒的这些重配株病毒。因此，每种疫苗种子源自原型株和甲型/PR8/34(H1N1)病毒之间遗传重配的过程，所述甲型/PR8/34(H1N1)病毒在卵中具有最佳的复制能力。病毒颗粒含有由单链RNA构成的8个独特的基因，每个基因编码1至3个特定的病毒蛋白：HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PB1、PB1F2、PB1N40、PB2和PA。因此，一种长期选择方法使得有可能获得疫苗重配株，其在PR8病毒的遗传背景上至少包含编码原型株的HA和NA的基因的区段(“6+2”组成)。然后，在卵中扩增三种疫苗重配株，其源自三种原型株与亲本甲型/PR/8/34株之间的遗传重配。自尿囊系统的产物纯化HA和NA抗原，与佐剂结合或不结合，以生成疫苗剂量。这种用于生产疫苗剂量的工业方法是长期的(4至6个月)。最近几年中已经开发出用于获得疫苗剂量的备选策略。实际上，使用细胞系来扩增疫苗重配株使得其中有可能不再依赖于“卵”系统(不足以管理流行病的卵数量)，以降低使用尿囊生产方法经常观察到的表面抗原变化，并且使得有可能为非变应原的。然而，目前，很少有制造商选择此新的生产方法，因为该工业方法目前的性能不如卵的性能那样好。为了使疫苗剂量生产时间降低至最小值，且以就剂量数目而言具有等同产量(yield)为目的，可以通过使用反求遗传学技术，使得有可能快速获得具有“6+2”组成的疫苗重配株，如此消除所有选择步骤来获得疫苗种子。通过反求遗传学生成重组病毒呈现用于有效地响应疫苗需求的最实际的备选方案。因此，通过反求遗传学生成重组病毒随后打开生成“经优化的”PR8病毒的可能性，这使得在它通过与原型株的遗传重配方法使用时有可能在卵中或在细胞中生成具有在疫苗剂量生产方面优化的病毒特征的疫苗重配株。在出现流行性致病性病毒的本上下文中，流感感染仅在工业化国家中可导致130至200万例住院和280,000至650,000例死亡(WHO数据)。疫苗剂量以固定的HA抗原数量(每剂每种病毒亚型为15μg)限定。NA抗原的阳性检测对于验证疫苗批次是必需的。主要的经济问题之一是能够降低疫苗剂量的制造成本(每次生产更多剂量和/或生产相同剂量数量的时间缩短)。Wanitchang等描述了在用S-OIV病毒的PB1基因替换重配株(“5+3”)甲型/PR/8/34病毒的PB1基因时表达H1N1(S-OIV)病毒的HA/NA糖蛋白的重配株病毒的生长改善和NA活性升高。然而，生长改善和NA活性升高对于S-OIVHA/NA糖蛋白是特异性的。此外，在包含S-OIVxa0PB1基因的重配株(“7+1”)甲型/PR/8/34病毒中没有检出生长改善和NA活性升高。此文件没有描述用于增加甲型/PR/8/34病毒表面上HA-NA糖蛋白数量的方法，它也没有描述经修饰的甲型/PR/8/34病毒，该经修饰的甲型/PR/8/34病毒在病毒表面上的HA-NA糖蛋白数量增加。本发明涉及生成更多表面糖蛋白的病毒株(疫苗重配株)及用于改善HA/NA表面糖蛋白的产生的方法。具体而言，本发明包括修饰通常用于生成流感病毒的疫苗种子的PR8病毒。此修饰存在于对PB1蛋白的某些氨基酸的修饰以获得具有更大的表面糖蛋白(HA和NA)数量和有利于NA的不同HA/NA比率的疫苗重配株。这些构成抗流感疫苗剂量的抗原。本发明使得有可能定量和定性优化甲和乙型流感病毒的疫苗种子。本发明的优点之一是通过相对于生成的给定数量的HA过表达NA来提高疫苗剂量的免疫原性。另一项优点是可得到一种系统，该系统使得有可能通过提高表面糖蛋白的表达来增加卵中或细胞中生成的疫苗剂量的数目。发明概述作为一个目的，本发明具有经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒，其在表面上的HA-NA(血凝素和神经氨酸酶)糖蛋白数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550个糖蛋白，所述经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒包含SEQxa0IDxa0NO:1的突变PB1基因，该突变PB1基因编码具有至少两个选自如下的特定氨基酸修饰的PB1蛋白：188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)。优选地，依照本发明的经修饰的病毒包含SEQxa0IDxa0NO:1的突变PB1基因，该突变PB1基因编码至少具有修饰563(I→R)和682(V→I)的PB1蛋白。在另一个实施方案中，依照本发明的甲型/PR/8/34病毒包含另一甲型流感病毒株的PB1基因，所述另一甲型流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白的数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550个糖蛋白。优选地，依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒包含具有SEQxa0IDNO:2序列的H3N2流感病毒的PB1基因。有利地，依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒是包含另一流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒。在另一个有利的实施方案中，依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒包含选自如下的流感病毒的HA和NA基因：具有H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亚型的病毒。本发明的另一个目的是一种用于生成流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其中在卵中或在细胞中扩增依照本发明的经修饰的流感病毒，该经修饰的流感病毒包含编码所述HA-NA疫苗糖蛋白的HA和NA基因。有利地，所述HA-NA疫苗糖蛋白选自具有H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亚型的病毒的糖蛋白。本发明还涉及用于增加甲型/PR/8/34流感病毒表面上HA-NA糖蛋白数量的方法，包括对所述甲型/PR/8/34流感病毒的SEQxa0IDxa0NO:1的PB1基因的修饰以将选自如下的至少两个特定的氨基酸修饰引入由所述PB1基因编码的PB1蛋白中：188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)。优选地，所述方法包括对所述甲型/PR/8/34流感病毒的SEQxa0IDxa0NO:1的PB1基因的修饰以将至少两个特定的氨基酸修饰563(I→R)和682(V→I)引入由所述PB1基因编码的PB1蛋白中。在另一个实施方案中，依照本发明的方法包括用另一甲型流感病毒株的PB1基因替换SEQxa0IDxa0NO:1的PB1基因，所述另一甲型流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550个糖蛋白。优选地，所述方法包括用具有SEQxa0IDxa0NO:2序列的H3N2流感病毒的PB1基因替换SEQxa0IDxa0NO:1的PB1基因。有利地，所述甲型/PR/8/34病毒是包含另一流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒。在另一个有利的实施方案中，所述甲型/PR/8/34病毒是包含选自如下的流感病毒的HA和NA基因的重配株病毒：具有H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亚型的病毒。作为一个目的，本发明还具有一种通过提高生成的糖蛋白的NA/HA比率来提高包含流感病毒的HA-NA糖蛋白的疫苗剂量的免疫原性的方法，其中在卵中或在细胞中扩增依照本发明的经修饰的流感病毒来生成糖蛋白。序列表SEQxa0IDxa0NO:1：甲型/PR8/8/34A(H1N1)流感病毒的PB1的蛋白质序列SEQxa0IDxa0NO:2：Moscow/10/99A(H3N2)流感病毒的PB1的蛋白质序列发明详述本发明根据出乎意料的观察结果，即不同流感病毒株在其表面上不具有相同数量的HA和NA糖蛋白。具体地，证明了制造商用于通过在经受精的鸡蛋中注射来扩增病毒的具有甲型/PR/8/34亲本株的遗传背景的流感病毒在其表面上比其它流感病毒株表达更小数量的HA和NA糖蛋白。此观察结果具有很大的意义，因为经典地使用具有甲型/PR/8/34遗传背景并表达HA和NA疫苗糖蛋白的重配株病毒来生成抗流感疫苗。疫苗剂量以每剂每种病毒亚型15μg的固定数量的HA抗原限定。增加由具有甲型/PR/8/34遗传背景的流感病毒生成的糖蛋白的数量就改善疫苗剂量生产产量和降低这些疫苗剂量的制造成本而言是主要问题。考虑到这些结果，现已出乎意料地发现了可以通过对具有甲型/PR/8/34遗传背景的病毒的PB1基因的遗传修饰来增加由此病毒生成的HA-NA糖蛋白的数量。如此，本发明涉及具有甲型/PR/8/34遗传背景并生成更大数量的原型株HA-NA糖蛋白的经修饰的病毒、用于增加HA-NA疫苗糖蛋白的生产产量的方法、及用于增加由甲型/PR/8/34病毒生成的糖蛋白数量的方法。本发明还涉及具有甲型/PR/8/34遗传背景且具有有利于NA的不同HA/NA比率的经修饰的病毒。具体地，本发明涉及包含经修饰的PB1基因的经修饰的甲型/PR/8/34病毒及经修饰的重配株甲型/PR/8/34病毒，该经修饰的重配株甲型/PR/8/34病毒包含经修饰的PB1基因和另一种病毒且具体地用于生产HA/NA疫苗抗原的原型病毒的HA和NA基因。本发明还涉及用于生成HA-NA糖蛋白的方法，包括在卵中扩增依照本发明的经修饰的病毒或重配株病毒。最后，作为一个目的，本发明还具有用于显著增加甲型/PR/8/34病毒或具有甲型/PR/8/34遗传背景的重配株病毒表面上HA-NA糖蛋白数量的方法。这些方法使得有可能改善HA-NA糖蛋白生产的产量。表述“甲型/PR/8/34流感病毒”指与甲型/PR/8/34株相关的病毒。1934年在波多黎各从患者采集，甲型/PR/8/34株产生自对在卵中生成流感病毒的适应。甲型/PR/8/34株的多种克隆已经得到开发，并且是本领域技术人员公知的。甲型/PR/8/34株以及自此株衍生的各种克隆已为ATCC保藏物的对象。具体地，它们是ATCC保藏物VR-95和VR-1469。使用此甲型/PR/8/34株作为亲本株以制备对于在卵中增殖以供疫苗产生具有高潜力的重配株病毒。制造商使用甲型/PR/8/34株的多种克隆，但是这些克隆在遗传上仍然非常相似，并且以在卵中生长以供疫苗产生的高能力为特征。甲型/PR/8/34病毒的8个基因段的序列以如下编号可自GenBank获得(HA:FJ888348.1、NA:CY038905.1、PB2:CY040177.1、PA:CY038908.1、NS:CY040174.1、PB1:CY040176.1、NP:CY040173.1和M:CY040171.1)。表述“经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒”指与其PB1基因经过修饰的甲型/PR/8/34株相关的病毒。甲型流感病毒包含8个基因，最特别是PB1、HA和NA基因。表述“具有经修饰的甲型/PR/8/34病毒的遗传背景的重配株病毒”指具有经修饰的甲型/PR/8/34病毒的6个基因(包括经修饰的PB1基因)和编码另一流感病毒株的HA和NA糖蛋白的基因的重配株病毒。编码HA和NA糖蛋白的基因通常来自野生型流感病毒(或原型病毒)，其已经基于彻底的抗原性和遗传研究(由WHO联合实验室进行)选择为代表大的流感病毒组。自临床样品直接培养这些野生型流感病毒(原型病毒)。因此，每年，WHO推荐从某些野生型流感病毒制备抗流感疫苗。具有经修饰的甲型/PR/8/34病毒的遗传背景的相应重配株病毒在卵中生长非常良好(甲型/PR/8/34株的特征)，并且表达HA和NA糖蛋白以供疫苗的产生。术语“重配株病毒”和“遗传重配”指以不同组合找到两种或几种流感病毒的基因，以生成具有每种亲本病毒基因的杂合病毒的方法。此遗传重配可以天然存在或可以在实验室中获得。依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒包含经修饰的PB1(聚合酶碱性蛋白1)基因。甲型流感病毒的PB1基因是本领域技术人员公知的。例如，甲型/PR/8/34PB1基因的序列以编号CY040176.1、CY038909.1、CY038901.1、EF190980.1和EF190972.1可自GenBank获得。甲型/PR/8/34流感病毒的多种克隆的PB1基因可具有少量序列趋异，即使PB1基因的遗传漂变(geneticxa0drift)较小。在一个具体的实施方案中，甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因编码SEQxa0IDxa0NO:1的PB1蛋白。在另一个具体的实施方案中，甲型/PR/8/34流感病毒的PB1蛋白编码SEQxa0IDxa0NO:1的PB1蛋白或此蛋白质的与SEQxa0IDxa0NO:1具有至少98%、99%或99.5%同一性的变体。表述“经修饰的PB1基因”指包含导致由此区段编码的蛋白质的氨基酸序列差异的对其序列的修饰的PB1基因。PB1基因编码三种蛋白质(PB1、PB1F2和PB1N40)，并且PB1蛋白是公知的，而且在病毒的复制/转录中发挥中心作用(无此蛋白质，则不发生复制)。其它蛋白质称作辅助的，并且了解不多。PB1F2蛋白似乎在体内发挥作用，而仅一项研究描述了PB1N40蛋白在转录中推定的作用。此外，传播病毒的所有PB1基因段不编码PB1F2蛋白。本领域技术人员会理解PB1基因的修饰因而可导致PB1、PB1F2和/或PB1N40蛋白的修饰。通过诱变甲型/PR/8/34PB1基因，且特别地通过将突变引入PB1基因序列中或者通过用另一流感病毒株的PB1基因替换甲型/PR/8/34PB1基因来获得包含经修饰的PB1基因的甲型/PR/8/34病毒。术语“HA-NA糖蛋白”指血凝素(HA)糖蛋白和神经氨酸酶(NA)糖蛋白。这些是甲型流感病毒表面上的特异性抗原性蛋白，其能够诱导中和性抗体的生成。甲型流感病毒依照其血凝素和神经氨酸酶的组合以16种HA亚型和9种NA亚型细分。依靠对其PB1基因的修饰，相对于不包含经修饰的PB1基因的甲型/PR/8/34病毒表面上通常存在的HA-NA糖蛋白数量，经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒和重配株流感疫苗病毒在其表面上具有增加数量的HA-NA糖蛋白，所述重配株流感疫苗病毒包含本发明的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒的遗传背景。优选地，包含经修饰的PB1基因的甲型/PR/8/34病毒的表面上的HA-NA糖蛋白数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550，600，且更优选650个糖蛋白。通过测量糖蛋白刺突间的距离测定表面糖蛋白(HA+NA)的数量，然后，将其与直径100nm的病毒的表面积联系起来。通过冷冻电子显微术测量四个糖蛋白刺突间的距离。在优选的实施方案中，甲型/PR/8/34株的PB1基因具有导致PB1蛋白中特定氨基酸修饰的修饰。优选地，PB1基因的修饰伴随甲型/PR/3/84毒素PB1蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的特定修饰。更优选地，PB1基因的修饰伴随甲型/PR/3/84株PB1蛋白的至少两个氨基酸的特定修饰。优选地，经修饰的PB1基因编码包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个选自如下的修饰的PB1蛋白：188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)。在本发明的一个有利的实施方案中，经修饰的PB1基因编码至少具有修饰188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)的PB1蛋白。更优选地，经修饰的PB1基因编码具有至少两个选自如下的修饰的PB1蛋白：188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)。有利地，经修饰的PB1基因编码至少具有修饰563(I→R)和682(V→I)的蛋白质。在其它实施方案中，用另一流感病毒株的PB1基因替换甲型/PR/8/34病毒的PB1基因，所述另一流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550、600或650个糖蛋白。在一个有利的实施方案中，用编码SEQxa0IDxa0NO:2的PB1蛋白的基因替换甲型/PR/8/34病毒的PB1基因。本发明还涉及重配株流感病毒，其具有依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒的遗传背景，而且包含另一流感病毒的HA和NA基因。如此，这些重配株病毒通常携带经修饰的甲型/PR/8/34病毒的6个基因(包括经修饰的PB1基因)和另一流感病毒株的2个基因，即编码HA和NA糖蛋白的基因。本发明的重配株病毒在卵中如甲型/PR/8/34病毒株那样生长非常良好，同时在其表面上生成更多的HA和NA糖蛋白。如此，在生成的重配株病毒数量相同的情况下，有可能生成更多的疫苗剂量。优选地，编码HA和NA糖蛋白的基因来自甲型病毒和有利地野生流感病毒(原型病毒)。有利地，编码HA和NA糖蛋白的基因来自传播的人或动物流感病毒，而与病毒亚型无关。在优选的实施方案中，编码HA和NA糖蛋白的基因来自选自如下的流感病毒：具有H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亚型的病毒。在某些实施方案中，本发明涉及重配株流感病毒，其包含甲型/PR/8/34病毒的5个基因和一个或多个其它流感病毒株的PB1、HA和NA基因。优选地，用另一流感病毒株的PB1基因替换甲型/PR/8/34病毒的PB1基因，所述另一流感病毒株的HA-NA表面糖蛋白数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550、600或650个糖蛋白。有利地，用编码SEQxa0IDxa0NO:2的PB1蛋白的基因替换甲型/PR/8/34病毒的PB1基因。本发明还涉及实现经修饰的甲型/PR/8/34病毒和具有经修饰的甲型/PR/8/34病毒的遗传背景的重配株病毒以供生成HA-NA糖蛋白的方法。依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34病毒和用经修饰的甲型/PR/8/34病毒获得的重配株病毒特别适合于通过在经受精的鸡蛋中或在细胞中扩增来生产疫苗种子。具有甲型/PR/8/34病毒的遗传背景(6个甲型/PR/8/34基因，包括经修饰的PB1基因)和野生型病毒(或原型病毒)的HA和NA基因的重配株病毒特别适合于生产HA-NA疫苗糖蛋白。依照标准技术在经受精的鸡蛋中或在细胞中扩增重配株病毒。在有利的实施方案中，本发明涉及用于生成流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其中在卵中或在细胞中扩增重配株病毒，其具有依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34流感病毒的遗传背景，并且包含编码所述HA-NA疫苗糖蛋白的HA和NA基因。优选地，HA-NA疫苗糖蛋白选自甲型流感病毒的HA-NA糖蛋白，且更特别地选自传播的人或动物流感(病毒)的HA-NA糖蛋白(而与病毒亚型无关)。在优选的实施方案中，HA和NA疫苗糖蛋白选自H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2和H3N1亚型。本发明还涉及通过这些方法获得的HA-NA糖蛋白。本发明还涉及用于在包含此病毒的PB1基因的修饰的甲型/PR/8/34流感病毒或重配株甲型/PR/8/34病毒的表面上增加HA-NA糖蛋白数量的方法。PB1基因的这些修饰在上文描述。相对于不包含经修饰的PB1基因的甲型/PR/8/34病毒或重配株甲型/PR/8/34病毒的表面上存在的糖蛋白数量，测量HA-NA糖蛋白数量的增加。在有利的实施方案中，此增加使得有可能获得如下的甲型/PR/8/34病毒或重配株甲型/PR/8/34病毒，其HA-NA表面糖蛋白的数量为对于直径100nm的病毒粒而言大于550、600或650个糖蛋白。优选地，此修饰包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因的修饰以将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个特定氨基酸修饰引入由所述PB1基因编码的PB1蛋白中。更优选地，此修饰包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因的修饰以将至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个选自如下的特定氨基酸修饰引入由所述PB1基因编码的PB1蛋白中：188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)。有利地，此修饰包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因的修饰以至少将特定氨基酸修饰188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)引入由所述PB1基因编码的PB1蛋白中。有利地，此修饰包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因的修饰以将至少两个选自下组的特定氨基酸修饰引入由所述PB1基因编码的PB1蛋白中：188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)。更有利地，此修饰包括所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因的修饰以将至少两个特定的氨基酸修饰563(I→R)和682(V→I)引入由所述PB1基因编码的PB1蛋白中。在其它实施方案中，所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因的修饰包括用另一流感病毒的PB1基因替换甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因，所述另一流感病毒的HA-NA表面糖蛋白数量为对于直径100nm的病毒体而言大于550、600或650个糖蛋白。优选地，所述甲型/PR/8/34流感病毒或所述重配株甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因的修饰包括用SEQxa0IDxa0NO:2的PB1基因替换甲型/PR/8/34流感病毒的PB1基因。本发明还涉及通过在卵中或在细胞中扩增具有甲型/PR/8/34遗传背景的重配株疫苗病毒来改善流感病毒的HA-NA疫苗糖蛋白的生成产量的方法，其中通过修饰甲型/PR/8/34PB1基因来增加所述重配株病毒表面上的HA-NA糖蛋白的数量。本发明还涉及用于制备重配株疫苗病毒以供生成HA-NA疫苗糖蛋白的方法，其中将依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34病毒的6个基因与编码原型流感病毒(野生型病毒)的HA和NA疫苗糖蛋白的两个基因组合。本发明的优点之一是通过相对于生成的固定数量的HA过表达NA来提高疫苗剂量的免疫原性。如此，本发明还涉及通过提高生成的糖蛋白的NA/HA比率来提高包含流感病毒HA-NA糖蛋白的疫苗剂量的免疫原性的方法，其中通过在卵中或在细胞中扩增具有依照本发明的经修饰的甲型/PR/8/34病毒的遗传背景的重配株病毒来生成糖蛋白。实施例实施例1：通过反求遗传学生成重组病毒我们依照我们实验室开发的方案通过反求遗传学生成9个重组病毒。重组病毒的基因组组成如下(表1)：病毒H3N2甲型/Moscow/10/99(MO)病毒H1N1甲型/PR/8/34(PR8)病毒A：“典型的”PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遗传背景上包含MO的HA和NA基因的区段病毒B：PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遗传背景上包含MO的HA、NA和PB1基因的区段。病毒C：PR8，其包含MO的PB1基因的区段病毒D：“典型的”PR8疫苗重配株，其包含禽流感H5N2A/Finch/England/2051/91(病毒FI)的HA和NA基因的区段病毒E：PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遗传背景上包含FI的HA和NA基因的区段和MO的PB1基因的区段病毒F：“典型的”PR8疫苗重配株，其包含人H3N2病毒甲型/California/10/04(病毒CAL)的HA和NA基因的区段病毒G：PR8疫苗重配株，其在PR8病毒的遗传背景上包含CAL的HA和NA基因的区段和MO的PB1基因的区段重组病毒的体外生成依靠用8个各包含基因区段的质粒转染293T细胞。在实验室中用其自身分子和细胞工具实施病毒生成。对9个重组病毒获得的生成产量在细胞中相似，并且符合重组病毒的正常生成。表1：通过反求遗传学生成的重组病毒的基因组组成ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>PR8：甲型/Puertoxa0Rico/10/34H1N1MO：甲型/Moscow/10/99H3N2FI：甲型/Finch/England/2051/91CAL：甲型/California/10/04H3N2实施例2：通过冷冻电子显微术对重组病毒表面上HA-NA糖蛋白密度的比较分析(表2)在蔗糖垫(cushion)上扩增并纯化通过反求遗传学生成的多种病毒。将网格上沉积的纯化的病毒在非常低的温度冷冻，并通过低温电子显微术观察。通过测量四个糖蛋白刺突间的距离确定表面糖蛋白(GP)的密度(ImageJ图像分析软件)，并依照下述公式将其与直径100nm的病毒的表面联系起来：4πR²，其中R=50nm。结果：病毒PR8：直径100nm的病毒表面上500个GP。病毒MO：直径100nm的病毒表面上689个GP。病毒A：直径100nm的病毒表面上500个GP。病毒B：直径100nm的病毒表面上700个GP。病毒C：直径100nm的病毒表面上598个GP。病毒D：直径100nm的病毒表面上498个GP。病毒E：直径100nm的病毒表面上640个GP。病毒F：直径100nm的病毒表面上502个GP。病毒G：直径100nm的病毒表面上703个GP。表2.糖蛋白(GP)的数量和NA酶活性ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>-就重组PR8H1N1病毒与重组MOxa0H3N2病毒之间的糖蛋白数量而言存在着显著的差异(对于H3N2病毒为+35%)。-与典型的疫苗组成对应的重组病毒A与PR8病毒具有类似的GP数量。-重组病毒B(包含MOxa0PB1基因)在其表面上具有与对MO病毒观察到的数量相同的GP数量。-PB1基因使得有可能获得每个直径100nm的病毒体包含等于700个GP的GP数量的重组疫苗病毒。-重组病毒C在其表面上具有比对病毒PR8观察到的数量大的GP数量(20%)。-对具有CAL株的H3N2GP的重组病毒F和G在其表面上找到由于MOPB1基因的区段所致的GP数量增加。-对具有FIxa0H5N2病毒的禽GP的重配株疫苗病毒(病毒D和E)观察到通过MOxa0PB1基因的区段介导的GP数量增加。实施例3：测定并比较重组病毒的神经氨酸酶(NA)活性(表2)。使用由实验室开发的实验方案(Ferraris等Vaccine2006)确定NA活性。由于对给定数量的病毒测定NA活性(对于10^E5个病毒的RFU)，观察到的变化反映病毒表面上的NA蛋白数量(对于相同的NA)。下文指示NAxa0RFU活性(对于包含人N2神经氨酸酶的病毒)的变化：MO：对于10E5个病毒为29340RFU病毒A：对于10E5个病毒为14600RFU病毒B：对于10E5个病毒为58000RFU病毒F：对于10E5个病毒为13897RFU病毒G：对于10E5个病毒为63470RFU。相对于重组病毒A和F(其是典型的重配株疫苗病毒)，对重组病毒B和G观察到的NA数量的增加。下文指示NAxa0RFU活性(对于包含禽N2神经氨酸酶的病毒)的变化：病毒D：对于10E5个病毒为8450RFU病毒E：对于10E5个病毒为36542RFU。相对于重组病毒D(其是典型的重配株疫苗病毒)对重组病毒E(MOxa0PB1基因的区段)观察到NA数量的增加。下文指示NAxa0RFU活性(对于包含N1神经氨酸酶的病毒)的变化：病毒PR8：对于10E5个病毒为14234RFU病毒C：对于10E5个病毒为63540RFU。相对于病毒PR8，对重组病毒C(MOxa0PB1基因的区段)观察到NA数量的增加。总之，包含MO病毒的PB1基因的典型重配株疫苗病毒具有比对于典型的疫苗重配株测量的NA酶活性更大的NA酶活性。将MO病毒PB1基因引入典型的重配株疫苗病毒的遗传背景中使得有可能：-增加病毒表面上的GP数目(+20%至+35%)，-增加病毒表面上的NA数目(NA活性升高)。实施例4：通过比较PR8H1N1和MOxa0H3N2病毒之间的氨基酸序列确定负责上文呈现的特性的特定H3N2PB1序列PB1蛋白的蛋白质序列比对显示PR8和MO之间30个氨基酸的差异。一种定向诱变策略使得有可能证明作为本专利申请目的的突变列表，所述定向诱变策略使得有可能修饰PR8PB1蛋白的蛋白质序列以获得MOxa0PB1蛋白的蛋白质序列。突变列表：188(K→E)、205(M→I)、212(L→V)、216(S→G)、398(E→D)、486(R→K)、563(I→R)、576(I→L)、581(E→D)、584(R→Q)、586(K→R)、617(D→N)、621(Q→R)、682(V→I)和691(R→K)。一种更精确的实验策略使得有可能鉴定所描述的生物学过程中牵涉的两个突变。将突变I563R和V682I引入PR8(病毒A)PB1蛋白中使得有可能获得与对于病毒B观察到的表型相似的表型(GP数量和NA活性)。参考文献Ferraris,O.,Kessler,N.,Valette,M.,Lina,B.,2006.Evolutionxa0ofxa0thexa0susceptibilityxa0toxa0antiviralxa0drugsxa0ofxa0A/H3N2influenzaxa0virusesxa0isolatedxa0inxa0Francexa0from2002to2005.Vaccine24,6656-6659Wanitchang等,Virusxa0Research,147,145-148,2010ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="349"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="294"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="298"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="294"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>